藥物分析之西藥分析——生物檢定統(tǒng)計(jì)法(一)

生物檢定統(tǒng)計(jì)法
一、總則
生物檢定法是利用藥物對生物體或其離體器官組織等所起的藥理作用來檢定藥物效價(jià)的方法，用于無適當(dāng)理化方法進(jìn)行檢定的藥物。
生物檢定統(tǒng)計(jì)法主要敘述應(yīng)用生物檢定時(shí)必須注意的基本原則、一般要求、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及統(tǒng)計(jì)方法。有關(guān)品種用生物檢定的具體實(shí)驗(yàn)條件和要求，必須按照該品種生物檢定法項(xiàng)下的規(guī)定。
生物檢定標(biāo)準(zhǔn)品 凡中國藥典規(guī)定用生物檢定的品種都有它的生物檢定標(biāo)準(zhǔn)品(s)。(s)都有標(biāo)示效價(jià)，以效價(jià)單位(u)表示，其含義和相應(yīng)的國際標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)單位一致。
供試品
供試品（t）或（u）是供檢定其效價(jià)的樣品，它的活性組分應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品基本相同。
a<[t]>或a<[u]>是（t）或（u）的標(biāo)示量或估計(jì)效價(jià)。
等反應(yīng)劑量對比
生物檢定是將（t）和其（s）在相同的實(shí)驗(yàn)條件下同時(shí)對生物體或其離體器官組織等的作用進(jìn)行比較，通過對比，計(jì)算出它們的等反應(yīng)劑量比值(r),以測得（t）的效價(jià)p<[t]>。
r是（s）和（t）等反應(yīng)劑量（ds、dt）的比值，即r＝ds/dt。
m是（s）和（t）的對數(shù)等反應(yīng)劑量（xs、xt）之差，即
m＝logds－logdt＝xs－xt。r＝antilogm。
p<[t]>是通過檢定測得（t）的效價(jià)含量,稱（t）的測得效價(jià)；是將效價(jià)比值(r)用(t)的標(biāo)示量或估計(jì)效價(jià)a<[t] >校正之后而得。即p<[t]>=a<[t]>·r或p<[t]>＝a<[t]> ·antilogm。
檢定時(shí)，（s）按標(biāo)示效價(jià)計(jì)算劑量,（t）按標(biāo)示量或估計(jì)效價(jià)(a<[t]>)計(jì)算劑量,注意調(diào)節(jié)（t）的劑量或調(diào)整其標(biāo)示量或估計(jì)效價(jià),使(s)和(t)的相應(yīng)劑量組所致的反應(yīng)程度相近。
生物變異的控制
生物檢定具有一定的實(shí)驗(yàn)誤差，其主要來源是生物變異性。因此生物檢定必須注意控制生物變異，或減少生物變異本身，或用適宜的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來減小生物變異對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，以減小實(shí)驗(yàn)誤差?？刂粕镒儺惐仨氉⒁庖韵聨c(diǎn)。
(1) 生物來源、飼養(yǎng)或培養(yǎng)條件必須均一。
(2) 對影響實(shí)驗(yàn)誤差的條件和因子，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)盡可能作為因級限制，將選取的因級隨機(jī)分配至各組。例如體重、性別、窩別、雙碟和給藥次序等都是因子，不同體重是體重因子的級，雌性雄性是性別因子的級，不同窩的動物是窩別因子的級，不同雙碟是碟間因子的級，給藥先后是次序因子的級等。按程度劃分的級（如動物體重），在選級時(shí)，應(yīng)選動物較多的鄰近幾級，不要間隔跳越選級。
(3) 按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)類型的要求將限制的因級分組時(shí)，也必須嚴(yán)格遵守隨機(jī)的原則。
誤差項(xiàng)
指從實(shí)驗(yàn)結(jié)果的總變異中分去不同劑量及不同因級對變異的影響后，剩余的變異成分，用方差(s<2>)表示。對于因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)類型的限制無法分離的變異成分，或估計(jì)某種因級對變異的影響小，可不予分離者，都并入s<2>。但劑間變異必須分離。
誤差項(xiàng)的大小影響標(biāo)準(zhǔn)誤s<[m]>和可信限（fl）。
不同的檢定方法和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)類型，分別按有關(guān)的公式計(jì)算s<[2]>。
可靠性測驗(yàn)
平行線檢定要求在實(shí)驗(yàn)所用的劑量范圍內(nèi)，對數(shù)劑量的反應(yīng)（或反應(yīng)的函數(shù)）呈直線關(guān)系，供試品和標(biāo)準(zhǔn)品的直線應(yīng)平行?？煽啃詼y驗(yàn)即驗(yàn)證供試品和標(biāo)準(zhǔn)品的對數(shù)劑量反應(yīng)關(guān)系是否顯著偏離平行偏離直線，對不是顯著偏離平行偏離直線（在一定的概率水平下）的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為可靠性成立，方可按有關(guān)公式計(jì)算供試品的效價(jià)和可信限。
可信限可信限（fl）標(biāo)志檢定結(jié)果的精密度。m的可信限是m的標(biāo)準(zhǔn)誤s<[m]>和t值的乘積（t·s<[m]>），用95％的概率水平。m＋t·s<[m]>是可信限的高限；m－t·s<[m]>是可信限的低限。用其反對數(shù)計(jì)算得r和p<[t]> 的可信限低限及高限，是在95％的概率水平下從樣品的檢定結(jié)果估計(jì)其真實(shí)結(jié)果的所在范圍。
r或p<[t]>的可信限率（fl％）是用r或p<[t]>的可信限計(jì)算而得。
計(jì)算可信限的t值是根據(jù)s<2>的自由度（f）查t值表而得。
t值與f的關(guān)系見表一。

表一 t值表（p＝0.95）　　────┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬────　　 　　f　│　 t　│　 f　│　 t　│　 f　│　 t　│　 f　│　　t　　────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────　　　 　3　│ 3.18 │　 8　│ 2.31 │　14　│ 2.15 │　30　│　2.04　　 　　4　│ 2.78 │　 9　│ 2.26 │　16　│ 2.12 │　40　│　2.02　　　 　5　│ 2.57 │　10　│ 2.23 │　18　│ 2.10 │　60　│　2.00　 　　　6　│ 2.45 │　11　│ 2.20 │　20　│ 2.09 │ 120　│　1.98　　 　　7　│ 2.37 │　12　│ 2.18 │　25　│ 2.06 │　∞　│　1.96　　────┴───┴───┴───┴───┴───┴───┴────

各品種的檢定方法項(xiàng)下都有其可信限率的規(guī)定,如果檢定結(jié)果不符合規(guī)定,可縮小動物體重范圍或年齡范圍，或調(diào)整對供試品的估計(jì)效價(jià)或調(diào)節(jié)劑量，重復(fù)實(shí)驗(yàn)以減小可信限率。
對同批供試品重復(fù)試驗(yàn)所得n次實(shí)驗(yàn)結(jié)果(包括fl％超過規(guī)定的結(jié)果)，可按實(shí)驗(yàn)結(jié)果的合并計(jì)算法算得p<[t]>的均值及其fl％作為檢定結(jié)果。
二、直接測定法
直接測得藥物對各個(gè)動物最小效量或最小致死量的檢定方法。如洋地黃及其制劑的效價(jià)測定。
xs和xt為s和t組各只動物的對數(shù)最小致死量， 它們的均值ys和yt為s和t的等反應(yīng)劑量，n<[s]>和nt為s和t組的動物數(shù)。
（注）：由于計(jì)算機(jī)內(nèi)無均值符號，故用ys和yt代替。
1.效價(jià)計(jì)算
按(1)～(3)式計(jì)算m、r和p<[t]>。
m＝y(tǒng)s －yt
(1)
r＝antilog（ys-yt）＝antilog m
(2)
p<[t]>＝a<[t]>·r
(3)
2.誤差項(xiàng)及可信限計(jì)算
按(4)～(8)式計(jì)算s<2>、s<[m]>及r或p<[t]>的fl和fl％。

∑(xs)<2>　　　　　　　?。ā苮t）<2>　　　　　　　∑(xs)<2>－ ───── ＋∑(xt)<2>－ ─────　　　　　　　　　　　　　　　ns　　　　　　　　　　　　nt　　s<2> ＝──────────────────────────　　(4)　　　　　　　　　　　　　　ns＋nt－2
f＝ns＋nt－2
用此自由度查表一得t值

┌─────────────　　　　　　　│　　　　　 ns＋nt　　s<[m]>＝　│　s<2> ·──────　　　　　　　√　　　　　　ns·nt
r的fl＝antilog(m±t·s<[m]>)

執(zhí)業(yè)藥師2017藥物分析學(xué)考點(diǎn)：生物堿類藥物的分析

第十四章 生物堿類藥物的分析

掌握鹽酸麻黃堿、硫酸阿托品、硫酸奎寧、鹽酸嗎啡和硝酸士的寧的鑒別、雜質(zhì)檢查和含量測定方法。

第一節(jié) 鹽酸麻黃堿的分析

一、鑒別

1.雙縮脲反應(yīng) 氨基醇特征反應(yīng)

與硫酸銅和氫氧化鈉試液反應(yīng)生成紫色配位化合物，加入乙醚后醚層呈紫紅色，水層呈藍(lán)色。

2.紅外光譜

3.Cl-反應(yīng)

二、含量測定：非水滴定法。本品為鹽酸鹽，需預(yù)先加入醋酸汞。

第二節(jié) 硫酸阿托品的分析

一、鑒別

1.Vitali反應(yīng) 托烷生物堿特征反應(yīng)：與發(fā)煙硝酸共熱，冷后加醇制氫氧化鉀，顯深紫色。

2.紅外光譜

3.硫酸鹽鑒別反應(yīng)

(1)加氯化鋇生成白色沉淀，沉淀在鹽酸或硝酸中不溶解

(2)加醋酸鉛生成白色沉淀，沉淀在醋酸銨或氫氧化鈉試液中溶解

(3)加鹽酸不生成白色沉淀，與硫代硫酸鹽區(qū)別

二、特殊雜質(zhì)檢查

1.莨菪堿檢查：阿托品為外消旋體，消旋不完全時(shí)引入的莨菪堿具有旋光性。測定供試品溶液旋光度來控制莨菪堿限量。

2.其他生物堿檢查：制備過程中引入的莨菪堿、顛茄堿等雜質(zhì)堿性弱于阿托品。取供試品鹽酸水溶液，加入氨試液，其他生物堿立即游離發(fā)生渾濁。規(guī)定加氨試液不得立即發(fā)生渾濁。

三、含量測定

1.原料藥 非水滴定法

1mol硫酸阿托品消耗1mol的高氯酸

2.片劑、注射劑 酸性染料比色法

在一定pH值條件下，生物堿鹽的陽離子和酸性染料的陰離子定量結(jié)合生成配位化合物，即離子對，此離子對易溶于有機(jī)溶劑，經(jīng)有機(jī)溶劑(氯仿等)提取后，比色測定含量。

(BH+)W +(In-)W → (BH+?In-)W →(BH+?Iln-)O

對照品比較法測定含量。

第三節(jié) 硫酸奎寧的分析

一、鑒別

1.熒光反應(yīng) 加水溶解后，加稀硫酸成酸性，顯藍(lán)色熒光

2.綠奎寧反應(yīng) 含氧喹啉衍生物特征反應(yīng)

在藥物微酸性水溶液中滴加微過量溴水，再加入過量氨試液，顯翠綠色。

3.硫酸鹽鑒別

4.紅外光譜

二、特殊雜質(zhì)檢查

1.氯仿-乙醇中不溶物檢查

檢查制備過程中引入的無機(jī)鹽與其他生物堿。取供試品2g，不溶物濾過干燥至恒重，遺留殘?jiān)坏眠^2mg。

2.其他金雞納堿的檢查：薄層色譜高低濃度對比法

三、含量測定

1.原料藥 非水滴定法 1mol硫酸奎寧消耗3mol的高氯酸

2.片劑 提取中和法 將適量樣品置于堿性溶液中，使奎寧游離，用氯仿提取后再用非水滴定法滴定。1mol硫酸奎寧消耗4mol的高氯酸。

藥物分析：常用定量分析法與應(yīng)用——生物檢定法

（一）概述
生物檢定法是利用藥物對生物體（整體動物、離體組織、微生物等）的作用以測定其效價(jià)或生物活性的一種方法。它以藥物的藥理作用為基礎(chǔ)、生物統(tǒng)計(jì)為工具，運(yùn)用特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過供試品和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌吩谝欢l件下比較產(chǎn)生特定生物反應(yīng)的劑量比例，來測得供試品的效價(jià)。

（二）生物檢定法的應(yīng)用范圍

1.藥物的效價(jià)測定對一些采用理化方法不能測定含量或理化測定不能反映臨床生物活性的藥物可用生物檢定法來控制藥物質(zhì)量。中國藥典收載了洋地黃、胰島素、肝素、絨促性素、縮宮素、硫酸魚精蛋白等的生物測定法及各種抗生素的微生物測定法。

有些天然藥物、生物制品（包括生化藥物）往往因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而且往往又是由結(jié)構(gòu)類似、比例不定的多種成份組成，很難用理化方法反映其生物活性；另一些藥物，尤其是一些激素類藥物，其結(jié)構(gòu)相近，而生物活性不同；還有些藥物雖可用理化方法測定含量，但含量不能完全反映效價(jià)，如天青a變色反應(yīng)測定肝素，測定結(jié)果與抗凝血效價(jià)不一致。因此，這些藥物的質(zhì)量控制都離不開生物檢定。

2.微量生理活性物質(zhì)的測定一些神經(jīng)介質(zhì)，激素等微量生理活性物質(zhì)，由于其很強(qiáng)的生理活性，在體內(nèi)的濃度很低，加上體液中各種物質(zhì)的干擾，很難用理化方法測定。而不少活性物質(zhì)的生物測定法由于靈敏度高、專一性強(qiáng)，對供試品稍作處理即可直接測定。如乙酰膽堿，5-羥色胺等活性物質(zhì)的測定。

3.中藥質(zhì)量的控制中藥成份復(fù)雜，大部分中藥的有效成份尚未搞清，難以用理化方法加以控制，但可用一些以其療效為基礎(chǔ)的生物測定方法來控制其質(zhì)量。

4.某些有害雜質(zhì)的限度檢查如農(nóng)藥殘留量、內(nèi)毒素等致熱物質(zhì)、抗生素及生化制劑中降壓物質(zhì)的限度檢查等。

由于生物差異的存在，生物檢定結(jié)果誤差較大，重現(xiàn)性較差，需要控制的條件較多，加上測定費(fèi)時(shí)，計(jì)算繁瑣，所以，生物檢定主要用于無適當(dāng)理化方法進(jìn)行檢定的藥物，補(bǔ)充了理化檢驗(yàn)的不足。